上海旦鼎流式细胞仪操作方法,流式细胞仪性能特点

一．开机程序

1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。

2．打开储液箱，倒掉废液,

并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow)，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。

4．如果需要打印，打开打印机电源。

5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。

7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止
后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)

1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。

3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram(直方图)。

4．将此视窗命名后储存于FACStation G3BD Applications CELLQuest FolderEXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。

本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3BD Applications CELLQuestEXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。

三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整

1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。

2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer(快捷键： ＋B)进行电脑和仪器的连机。将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置。

3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。

4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifiermode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDMParam选择FL2，而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。

5．放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

6．在Acquisiton

Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。

7．在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages(粗调)与AmpGains(细调)，使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。

8．在Threshold

对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

9．从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域)，并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。

10．Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器(FL1, FL2, FL3,FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。

11．在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2-

的细胞群却分布在FL1＋ FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当

12．在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右。

13．调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。

本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 BD Applications CELLQuest FolderIMM-InstrSettings及FACStation G3 BD Files Instrument Settings FilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。

流式细胞仪的十大应用

　　1、DNA倍体分析　　DNA分析是流式细胞仪*初且是现在应用*广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。　　在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。　　2、细胞生存能力实验　　使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。　　3、计数外周血中检测网织红细胞　　使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。　　4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。　　5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验　　检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。　　6、血小板自身抗体检测　　血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。　　7、移植交叉配型　　原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。　　8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。　　9、细胞增殖状态检测　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。　　10、染色体分析　　流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。